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Higher purities with orthogonal peptide purification using PurePep EasyClean
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SPPS를 통해 합성된 친수성 펩타이드 히스톤 H3(1-20)의 정제는 불순물이 함께 용출되기 때문에 매우 까다로운 과제입니다.
이 예에서는 간단한 직교 정제 접근법에서 PurePep EasyClean 스타터 키트와 RP-HPLC를 사용하여 더 높은 순도와 더 낮은 용매 소비를 달성하는 방법을 보여줍니다. |
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소개
펩타이드 관련 불순물은 주로 약물 연구 및 개발 결과에 큰 영향을 미칠 수 있으며(예: 거짓 양성 결과), 높은 검사 신뢰성을 보장하기 위해 제거되어야 합니다. 궁극적으로 이러한 불순물은 활성 의약 성분에서 완전히 제거되어 최고 품질의 임상용 재료를 제공해야 합니다.
화학적으로 합성된 펩타이드의 정제는 주로 전통적인 크로마토그래피 방법을 통해 이루어집니다. 역상 고압 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)가 가장 일반적으로 사용되는 방법입니다. 또한, 역상 플래시 크로마토그래피(플래시)는 연구용 펩타이드 정제 및 높은 등급 물질의 중간 정제/클린업 단계에서 확립된 기술을 나타냅니다. 그러나 이러한 크로마토그래피 기술 모두에서 유사한 특성으로 인해 동시에 나타나는 불순물이 간과될 수 있습니다.
반면에, 화학 선택적 분리 원칙은 Gyros Protein Technologies의 직교 정제 PurePep EasyClean 기술을 주도합니다. 고체상 펩타이드 합성(SPPS) 중 캡핑(capping)은 SPPS의 끝에서 트레이스리스 클리버블 정제 링커(PEC-링커)를 사용하여 특정 펩타이드만이 수정을 위해 접근 가능하도록 보장합니다. 그 후 대상 펩타이드는 수정된 비드에서의 직교적 캐치 앤 릴리스를 통해 복잡한 혼합물에서 분리될 수 있습니다.[1-2]
화학적으로 합성된 펩타이드의 정제는 주로 전통적인 크로마토그래피 방법을 통해 이루어집니다. 역상 고압 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)가 가장 일반적으로 사용되는 방법입니다. 또한, 역상 플래시 크로마토그래피(플래시)는 연구용 펩타이드 정제 및 높은 등급 물질의 중간 정제/클린업 단계에서 확립된 기술을 나타냅니다. 그러나 이러한 크로마토그래피 기술 모두에서 유사한 특성으로 인해 동시에 나타나는 불순물이 간과될 수 있습니다.
반면에, 화학 선택적 분리 원칙은 Gyros Protein Technologies의 직교 정제 PurePep EasyClean 기술을 주도합니다. 고체상 펩타이드 합성(SPPS) 중 캡핑(capping)은 SPPS의 끝에서 트레이스리스 클리버블 정제 링커(PEC-링커)를 사용하여 특정 펩타이드만이 수정을 위해 접근 가능하도록 보장합니다. 그 후 대상 펩타이드는 수정된 비드에서의 직교적 캐치 앤 릴리스를 통해 복잡한 혼합물에서 분리될 수 있습니다.[1-2]
Animation of PurePep EasyClean orthogonal purification technology
토론
PEC 등급 펩타이드.
정제하지 않은 히스톤 H3 (1-20)의 UV 크로마토그램은 한눈에 보기에 매우 깨끗해 보입니다(그림 1, 좌측). 그러나 대응되는 피크의 질량 분석에서 여러 개의 캡된 삭제 서열이 조립되었습니다(그림 1 좌측 삽입 그림). 주요 불순물로는 알라닌(A), 아르기닌(R), 그리고 스레오닌(T) 삭제가 있었습니다. 0.1% HFBA를 사용한 분석용 HPLC 실행으로 기저의 피크를 해결하였고, 원시 순도는 29%로 결정되었습니다(크로마토그램은 표시되지 않음).
정제하지 않은 히스톤 H3 (1-20)의 UV 크로마토그램은 한눈에 보기에 매우 깨끗해 보입니다(그림 1, 좌측). 그러나 대응되는 피크의 질량 분석에서 여러 개의 캡된 삭제 서열이 조립되었습니다(그림 1 좌측 삽입 그림). 주요 불순물로는 알라닌(A), 아르기닌(R), 그리고 스레오닌(T) 삭제가 있었습니다. 0.1% HFBA를 사용한 분석용 HPLC 실행으로 기저의 피크를 해결하였고, 원시 순도는 29%로 결정되었습니다(크로마토그램은 표시되지 않음).
그림 1(오른쪽)은 PEC 정제된 펩타이드의 크로마토그램을 보여줍니다. 질량 스펙트럼의 더 자세한 분석(그림 1, 오른쪽 삽입 그림)에서 PEC가 단일 단계에서 공존하는 불순물을 효율적으로 제거하여 높은 검사 신뢰성을 보장한다는 것을 확인할 수 있습니다.
HFBA의 대상 펩타이드와 절단된 서열을 분리할 능력으로, HFBA 향상된 역상 플래시 크로마토그래피가 비교용으로 첫 번째 차원 크로마토그래피 정제로 활용되었습니다. 적용된 방법으로 순도가 66%로 증가하였습니다(표 2). 반면에, 직교 PEC로 한 번의 실행은 86%의 PEC 등급 순도를 결과로 얻었습니다.
PEC 임상등급 펩타이드
PEC와 함께 직교 크로마토그래피를 사용하여 공존하는 불순물이 있는 펩타이드에 대해 PEC가 우수한 정제 효율을 명백히 입증하여, 클리니컬 등급의 펩타이드를 얻기 위해 플래시 등급 및 PEC 등급 펩타이드를 두 번째 차원 정제로 추가적인 RP-HPLC 정제를 수행했습니다. 원시 순도가 각각 29%에서 85% 및 96%로 순도가 증가하였습니다(표 2), 이는 PEC의 우수한 정제 효율을 보여주며, 원시 혼합물에서 공존하는 불순물을 가진 펩타이드에 대한 크로마토그래피와의 직교 조합에서의 우월성을 명확히 입증하고 있습니다.
HFBA의 대상 펩타이드와 절단된 서열을 분리할 능력으로, HFBA 향상된 역상 플래시 크로마토그래피가 비교용으로 첫 번째 차원 크로마토그래피 정제로 활용되었습니다. 적용된 방법으로 순도가 66%로 증가하였습니다(표 2). 반면에, 직교 PEC로 한 번의 실행은 86%의 PEC 등급 순도를 결과로 얻었습니다.
PEC 임상등급 펩타이드
PEC와 함께 직교 크로마토그래피를 사용하여 공존하는 불순물이 있는 펩타이드에 대해 PEC가 우수한 정제 효율을 명백히 입증하여, 클리니컬 등급의 펩타이드를 얻기 위해 플래시 등급 및 PEC 등급 펩타이드를 두 번째 차원 정제로 추가적인 RP-HPLC 정제를 수행했습니다. 원시 순도가 각각 29%에서 85% 및 96%로 순도가 증가하였습니다(표 2), 이는 PEC의 우수한 정제 효율을 보여주며, 원시 혼합물에서 공존하는 불순물을 가진 펩타이드에 대한 크로마토그래피와의 직교 조합에서의 우월성을 명확히 입증하고 있습니다.
용매 경제성.
크로마토그래피 분리는 유기 용매를 대량으로 사용합니다. 따라서, 유기 용매 사용을 줄이는 것은 초록 화학의 12가지 원칙 중 하나인 유용성을 향상시키는 핵심입니다.
ACN 소비는 직교 접근의 생태적 이점을 평가하는 합리적인 지표입니다. PEC의 캐치 앤 릴리스 원칙으로 인해 사용자는 소량의 유기 용매를 사용하고 적은 폐기물을 생산합니다. 과정 중에는 ACN 50 mL과 총 200 mL의 폐기물만이 축적되었습니다.
반면에, 플래시 정제에는 MeCN 500 mL이 필요하며 총 용매 1500 mL을 생산하여 전체 용매 사용량 및 폐기물을 85% 이상 절감하였습니다.
추가적인 RP-HPLC 정제 실행을 고려할 때, ACN 1000 mL 및 총 3000 mL의 폐기물이 추가되었습니다.
RP-HPLC와 결합된 직교 PEC 정제는 비용이 많이 드는 용매 및 유해 폐기물의 총 절약량이 약 30% 정도입니다.
크로마토그래피 분리는 유기 용매를 대량으로 사용합니다. 따라서, 유기 용매 사용을 줄이는 것은 초록 화학의 12가지 원칙 중 하나인 유용성을 향상시키는 핵심입니다.
ACN 소비는 직교 접근의 생태적 이점을 평가하는 합리적인 지표입니다. PEC의 캐치 앤 릴리스 원칙으로 인해 사용자는 소량의 유기 용매를 사용하고 적은 폐기물을 생산합니다. 과정 중에는 ACN 50 mL과 총 200 mL의 폐기물만이 축적되었습니다.
반면에, 플래시 정제에는 MeCN 500 mL이 필요하며 총 용매 1500 mL을 생산하여 전체 용매 사용량 및 폐기물을 85% 이상 절감하였습니다.
추가적인 RP-HPLC 정제 실행을 고려할 때, ACN 1000 mL 및 총 3000 mL의 폐기물이 추가되었습니다.
RP-HPLC와 결합된 직교 PEC 정제는 비용이 많이 드는 용매 및 유해 폐기물의 총 절약량이 약 30% 정도입니다.
결과 요약
- 단일 직교 정제 단계에서 불완전한 펩타이드를 효과적으로 제거합니다.
- 직교 PEC와 RP-HPLC를 결합하여 까다로운 펩타이드에 최고 순도를 얻습니다.
- 직교 PEC 정제로 용매 사용 및 전체 폐기물을 최대 85%까지 절약합니다.
PurePep EasyClean 스타터 키트 살펴보기
참조
- Zitterbart et al. Chemical Science 2021, 12, p. 2389-2396
- Reimann ; Seitz O.; Sarma D.; Zitterbart R. J. Pep. Sci. 2019; 25:e3136
